Qual è il metodo di rilevamento dell'attività delle proteasi alcaline?

Qual è il metodo di rilevamento dell'attività delle proteasi alcaline?

    L'attività enzimatica si riferisce alla capacità di un enzima di catalizzare determinate reazioni chimiche. La dimensione dell'attività dell'enzima può essere espressa dalla velocità di una determinata reazione chimica che catalizza in condizioni corrispondenti. Misurare l'attività dell'enzima di proteasi alcalina di Liaoning sta effettivamente misurando la velocità della reazione chimica catalizzata dall'enzima. La velocità della reazione enzimatica può essere espressa dalla diminuzione del substrato di reazione o dall'aumento del prodotto per unità di tempo. Per motivi di sensibilità, viene solitamente misurata la quantità di prodotto prodotta per unità di tempo. Poiché la velocità della reazione enzimatica può gradualmente diminuire il suo valore di aumento nel tempo, al fine di misurare correttamente l'attività dell'enzima, è necessario determinare la velocità iniziale della reazione enzimatica.

Principio di determinazione dell'attività di proteasi alcaline Principio del metodo di Folin

     La proteasi alcalina può catalizzare l'idrolisi della caseina in tirosina in condizioni alcaline. La tirosina è un amminoacido contenente un gruppo idrossilico fenolico e può reagire con Folin (una miscela di acido fosfotungstico e acido fosfomolibdico). (Reazione di fenolo folin: il reagente folin è estremamente instabile in condizioni alcaline ed è facile essere ridotto quantitativamente dai composti fenolici per produrre una miscela di blu di tungsteno e blu di molibdeno, mostrando una diversa tonalità di blu.) Usando la colorimetria la quantità di tirosina prodotta può essere determinata e la quantità di tirosina prodotta dall'idrolisi della caseina dalla proteasi alcalina Liaoning in un tempo unitario viene utilizzata per esprimere l'attività dell'enzima, calcolando così l'attività dell'enzima.

Procedura sperimentale per la determinazione dell'attività della proteasi alcalina

    Preparazione della soluzione enzimatica: pesare accuratamente 1 g (± 0,001) di polvere di enzima secca, aggiungere 10 ml di soluzione tampone (2.2.5), sciogliere in un piccolo becher e mescolare con un'asta di vetro. Dopo un po 'di tempo, versare con cura la soluzione dello strato superiore in un pallone volumetrico Nel mezzo, aggiungere una piccola quantità di soluzione tampone alla parte del sedimento, mescolare e sciogliere 4 volte in questo modo, e infine trasferire tutto in un pallone volumetrico da 100 ml . Compensare il segno con una soluzione tampone, agitare bene e filtrare con quattro strati di garza. Disegnare 5 ml di filtrato, trasferirlo in un matraccio tarato da 100 ml, diluire sul segno con acqua distillata e diluire il liquido enzimatico con un livello di 2000 volte.

Definizione dell'attività della proteasi alcalina

     Definizione di unità di attività della proteasi alcalina: 1 grammo di polvere di proteasi alcalina può produrre 1 microgrammo di tirosina al minuto nelle condizioni di pH10 e 40 ° C, che è considerata un'unità di attività enzimatica.

 Precauzioni per la determinazione dell'attività della proteasi alcalina

  1. La temperatura, il pH e il tempo della reazione enzimatica hanno un impatto diretto sul numero di legami peptidici idrolizzati, quindi deve essere rigorosamente controllato.

  2. Dopo aver terminato la reazione con acido tricloroacetico, il filtrato ottenuto filtrando la miscela di reazione deve essere chiaro.

  3. Poiché il reagente Folin è sensibile all'ambiente acido ed è soggetto a cambiamenti, durante la misurazione è necessario stabilire un ordine. È necessario aggiungere una soluzione di carbonato di sodio per formare un ambiente alcalino, quindi aggiungere il reagente Folin per farlo funzionare normalmente.

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