Test di Bacillus Subtilis nei preparati microbici per mangimi

ICS 65.120                                                                                                                  Cn. di lassificazione: B 46

GB/T 26428-2010

PStandard nazionali della Repubblica popolare cinese

Standard di prova per Bacillus Subtilis nei mangimi

Emesso il: 14-01-2011                                                                                  

Implementato: 01-07-2011 

Rilasciato da:PRepubblica popolare cinese Amministrazione generale della supervisione della qualità, dell'ispezione e della quarantena e Comitato nazionale di gestione della standardizzazione della Cina

Prefazione

Questa norma è redatta secondo le norme di GB/T 1.1-2009.

Questo standard è sotto la giurisdizione del National Feed Industry Standardization Technical Committee (SAC/TC 76).

Questo standard è stato proposto e redatto da: The Microbiological Analysis and Testing Center of Guangdong Province.

I principali redattori di questo standard sono: Honghui Zhu, Xiaotang Sun, Songzhen Yang, Yuanliang Chen e Xianjiao Zhang.

Test di Bacillus Subtilis nei preparati microbici per mangimi

1. Ambito di applicazione

Questa norma definisce le norme per l'analisi del bacillus subtilis nelle preparazioni microbiche dei mangimi.

Questa norma è applicabile alle prove e ai calcoli del bacillus subtilis nelle preparazioni microbiche dei mangimi.

2. Referenze normative

I seguenti documenti sono essenziali per l'applicazione del presente documento. Per i riferimenti datati, a questo documento si applica solo la versione datata. Per i documenti citati senza data, a questo documento si applica l'ultima versione (comprese tutte le modifiche):

GB/T 8170 Regole di arrotondamento numerico ed espressione e giudizio di valori limite

Campionamento alimentazione GB/T 14699.1 (GB/T 14699.1 – 2005, ISO 6497: 2002, IDT)

GB/T 20195 Mangime per animali: preparazione del campione (GB/T 20195 – 2006, ISO 6498: 1998, IDT)

3. Diluenti, medium e reagenti

Salvo diversa indicazione, nell'analisi devono essere utilizzati solo reagenti analiticamente puri e acqua distillata o deionizzata o equivalentemente pura.

3.1.  Soluzione salina sterilizzata allo 0,85%.

3.2.  Terreno di agar nutrizionale (NA), vedere A.1 dell'appendice A

3.3.  Soluzione di colorazione di Gram, vedere A.2 dell'Appendice A

3.4.  Mezzo di crescita del cloruro di sodio al 7%, vedere A.3 dell'Appendice A

3.5.  Test VP di mezzi e reagenti, vedere A.4 dell'Appendice A

3.6.  Mezzo di riduzione dei nitrati e reagenti, vedere A.5 dell'appendice A

3.7.  Mezzo di fermentazione del D-mannitolo, vedere A.6 dell'appendice A

3.8.  Mezzo di utilizzo del propionato, vedere A.7 dell'Appendice A

4. Attrezzature e cristalleria

Oltre alle apparecchiature di laboratorio comunemente utilizzate in microbiologia, altre apparecchiature e vetreria elencate come segue:

4.1.  Incubatrice termostatica: 37 ºC ± 1 ºC

4.2.  pHmetro, preciso fino a ± 0,1 unità

4.3.  Piastra Petri in vetro o plastica

4.4.  Pipetta graduata con capacità di marcatura di 1 ml e 10 ml, con scala minima rispettivamente di 0,1 ml e 0,5 ml

4.5.  Asta in vetro o plastica

4.6.  Microscopio, con zoom 1000 volte

5. Campionamento

I campioni di prova sono reali e rappresentativi. Gli strumenti di campionamento come pale, campionatori a cucchiaio, provette, barattoli, forbici, ecc. devono essere sterilizzati.

I campioni devono essere inviati alla sala prove microbiologiche il prima possibile. La dimensione e il metodo di campionamento dovrebbero essere implementati secondo GB/T 14699.1.

6. Preparazione del campione

La preparazione del campione deve essere implementata secondo GB/T 20195 e il campione deve essere ispezionato il prima possibile dopo la preparazione.

7. Procedure operative

7.1. Preparazione del campione per l'ispezione e sospensione iniziale e diluizione dieci volte.

Utilizzando operazioni e condizioni asettiche, pesare 25 g (ml) del campione, aggiungere 225 ml di soluzione fisiologica sterilizzata allo 0,85%, omogeneizzare per 1-2 min e fare una sospensione iniziale di 1:10. Quindi, aspirare 1 ml della sospensione iniziale di 1:10, aggiungere 9 ml di soluzione fisiologica sterilizzata allo 0,85% e mescolare accuratamente per ottenere una diluizione 1:100. A seconda del contenuto batterico del campione, effettuare ulteriormente una diluizione dieci volte crescente in serie.

7.2.  Inoculazione e cultura

Scegliere 2-3 diluizioni adatte, conservare e mantenere per 10 minuti a bagnomaria a 80 ºC ± 1 ºC, aspirare 0,1 ml con una pipetta sterile e inoculare due piastre di agar nutrizionale (3.2). Utilizzare l'asta di rivestimento per applicare l'inoculo sulla superficie dell'agar nel modo più accurato e rapido possibile. L'asta di rivestimento non deve toccare il bordo della capsula di Petri. Utilizzare un'asta di rivestimento sterile per ogni piatto. Coprire la capsula di Petri rivestita e lasciarla riposare a temperatura ambiente per 15 minuti, in modo che l'inoculo sia completamente assorbito dall'agar. Capovolgere la piastra e metterla in un'incubatrice a 37 ºC ± 1 ºC per 48 ± 2 h.

7.3. Conteggio e screening delle colonie

Dopo l'incubazione, selezionare una piastra con un numero di colonie compreso tra 30 e 300. Se nel piatto crescono grandi colonie a forma di scaglia, non è dichiarato per l'uso. Tuttavia, se le colonie a forma di scaglia sono meno della metà del piatto e la distribuzione delle colonie nella metà rimanente è molto uniforme, puoi calcolare metà del conteggio delle colonie nel piatto e moltiplicare il risultato per 2 per rappresentare il conteggio totale delle colonie del piatto. La colonia del tipico Bacillus Subtilis è ruvida, opaca, non lucida, con bordi dilatati, rotondi o ondulati, di forma irregolare e di aspetto bianco grigiastro o giallastro. Infine, selezionare 5 colonie che presentano queste caratteristiche per la conferma dell'esperimento.

7.4. Test di conferma

7.4.1. Panoramica

Al momento, se il mezzo di coltura utilizzato nei kit commerciali di identificazione biochimica o nelle provette di identificazione biochimica è lo stesso del mezzo utilizzato nel test di conferma di questo standard, questi kit o provette possono essere utilizzati in conformità con le istruzioni sui prodotti per effettuare tale conferma sperimentare.

7.4.2. Preparazione del ceppo

Scegliere una singola colonia dalla capsula di Petri e strisciare la cultura sulla piastra di agar nutrizionale e coltivare a 37 ºC ± 1 ºC, per 48 ± 2 h. Almeno una colonia caratteristica ben isolata deve essere prelevata da ciascuna piastra, strisciata e trasferita sulla piastra di agar e conservata per il test di conferma.

7.4.3. Osservazione morfologica

Le colonie purificate selezionate sono state esaminate al microscopio con colorazione di Gram (3.3). Le cellule del Bacillus Subtilis devono essere a forma di bastoncino, con spore ovali, mesozoiche o vicine al mesozoico, e le cisti non devono essere ingrandite in misura significativa.

7.4.4. Test di conferma fisiochimica

Le colonie purificate sono state selezionate per il test di: crescita del cloruro di sodio al 7% (3.4), test VP (3.5), riduzione dei nitrati (3.6), fermentazione del D-mannitolo (3.7) e utilizzo del propionato (3.8).

7.4.5. Conferma dei risultati

La conferma dei risultati è la seguente:

1. Le colonie di Bacillus Subtilis hanno superficie ruvida, sono opache, di aspetto bianco grigiastro o giallastro, sono a forma di bastoncino con spore di forma ovale, mesozoiche o quasi mesozoiche, con cisti non significativamente ingrandite.

2. I risultati del test sono positivi per la crescita del cloruro di sodio del 7%, il test VP e la riduzione dei nitrati.

3. L'acido può essere prodotto tramite la fermentazione del D-mannitolo.

4.d

+

+

8. Calculation of Results and Report

8.1.  Calculating the Number of Bacillus Subtilis Colonies on each dish.

Calculate the number of Bacillus Subtilis colonies (a) on each dish using Formula 1:

Formula 1

a = (b ÷ A) x C

Legend:

a: Number of Bacillus Subtilis colonies on each dish;

b: Number of colonies confirmed as Bacillus Subtilis colonies after sample selection;

A: Number of colonies selected for confirmation (5);

C: Number of colonies on the dish that embodies the distinguishing features of Bacillus Subtilis.

The final result (a) should be rounded to the nearest whole number according to the numerical rounding rules in GB/T 8170.

For Example:

If there is a total of 78 colonies on the dish that feature characteristics of Bacillus Subtilis, 5 are selected for the confirmation testing, and 4 of which are confirmed to be Bacillus Subtilis colonies, then:

a = (4 / 5) x 78 = 62.4

a = 62.4 ~ 62

According to the numerical rounding rules in GB/T 8170, the number of Bacillus Subtilis colonies (a) on this dish is 62.

8.2.  Number of Bacillus Subtilis Colonies in Sample: Calculation Method & Report

Choose 2 serial dilution dishes (each dilution should have at least one dish, with a confirmed number of Bacillus Subtilis between 30 – 300 on the dish.), calculate using Formula 2, which is 1 ml or 1 g of Bacillus Subtilis in the sample, N.

Formula 2

N = Ʃa / V · (n₁ + 0.1n₂) · d

Legend:

N: The total number of Bacillus Subtilis in the sample;

Ʃa: The total sum of confirmed Bacillus Subtilis on all dishes;

V: Inoculation volume of the dish, ml;

n₁: Number of dishes for the first dilution;

n₂: Number of dishes for the second dilution;

d: The dilution factor of the first dilution (the value of d for undiluted samples is 1).

The final result (N) should be rounded to the nearest 2 significant digits according to the numerical rounding rules in GB/T 8170. The number of Bacillus Subtilis colonies in the sample can also be recorded using Scientific Notation (1.0 – 9.9 times 10^x).

Report the estimated number of Bacillus Subtilis per ml or g of the sample, CFU/g or CFU/ml.

Example 1:

If after the first dilution (10^-3), the confirmed number of Bacillus Subtilis colonies are 168 and 215 respectively, and after the second dilution (10^-4), the confirmed number of Bacillus Subtilis colonies are 34 and 35 respectively, then:

N = (168 + 215 + 34 + 35) / [0.1 x (2 + 0.1 · 2) x 10^-3]

N = 472 / 0.00022

N = 2145450 ~ 2100000

According to the numerical rounding rules in GB/T 8170, the estimated number of Bacillus Subtilis of the sample in this example in units of g or ml, is 2100000 CFU/g (or ml), or 2.1 x 10⁶ CFU/g (or ml).

Example 2:

If the last dilution (10^-4) confirms that the number of Bacillus Subtilis colonies are 120 and 130 respectively, then:

N = (120 + 130) / (0.1 x 2 x 10^-4)

N = 250 / 0.00002

N = 12500000 ~ 12000000

According to the numerical rounding rules in GB/T 8170, the estimated number of Bacillus Subtilis of the sample in this example in units of g or ml, is 12000000 CFU/g (or ml), or 1.2 x 10⁷ CFU/g (or ml).